关于克隆： [复制链接]

“火奴鲁鲁”技术


--------------------------------------------------------------------------------

　　　1998年7月，夏威夷大学的科学家们宣布他们培育出3只克隆鼠，Teruhiko Wakayama and Ryuzo Yanagimachi是此项技术的发明者。

　　长时间以来，小鼠是最难克隆的哺乳动物之一，是因为小鼠的卵细胞受精后便很快开始分裂。在罗斯林技术中采用绵羊作为克隆对象，是由于它们的卵细胞在分裂前有几个小时的时间，有足够的时间来重新改变细胞核。Wakayama和Yanagimachi在这种情况下仍然成功地完成了克隆，且成功率更高（一百个受精卵中有3个克隆），而Ian Wilmut是在277次尝试中才获得一次成功。

　　在细胞周期同步的问题上，Wakayama采取了与Wilmut完全不同的方法。Wilmut采用的乳腺细胞能在处理后静止于G0期，Wakayama从开始就尝试了3种不同类型的细胞：滋养细胞，脑细胞和卵丘细胞。滋养细胞和脑细胞天然就保持于G0期，而卵丘细胞常常处于G0期或G1期。

　　未受精的小鼠卵细胞用做细胞胞核受体，卵细胞在除去核后，接受供体细胞核。不同于多利的处理，实验无须卵细胞的体外培养过程：一小时后，卵细胞已经接受了新的核；五小时后，将卵细胞置于化学培养液中开始细胞生长的过程，如同天然受精一样。在培养液中含有细胞松弛素B，能抑制极体的形成，防止遗传物质丢失。

　　如图所示

　　在开始生长后，细胞成为胚胎，转移入代理母亲体内养育。在这些过程中，最为成功的是卵丘细胞，因此研究者们将注意力集中到卵丘细胞上。证实了这种技术的可行性后，Wakayama将克隆鼠进行再克隆，并且让克隆鼠繁殖，以证实它们有生育能力。只到他对外公布他的成果时，他已经克隆出50个克隆鼠。

　　由于人们对小鼠的细胞功能和基因组有一定的了解，此项新技术使人们能更深入地了解卵细胞分裂的机制。此外，小鼠的繁殖期只有几个月，较绵羊短，有利于观察克隆技术的长期结果。

　　“火奴鲁鲁”技术与克隆多利技术的不同之处，即高明之处就在于采用化学液体而不是细胞培养液来刺激卵细胞分化，科学家们认为，化学刺激比起电休克而言，对细胞的损伤较小，成功率也较高。

Xena的诞生


--------------------------------------------------------------------------------

　　　今年7月2日，又有一只克隆猪Xena问世。Xena的诞生结合了“火努鲁鲁”技术和“多利”克隆技术的优点。采用胚胎纤维原细胞作为供体细胞，因为此种细胞易于基因改造。科学家们从母猪体内分离成熟卵母细胞，在体外培养，并采用电刺激使之开始分裂。实验中，科学家们观察到体内成熟卵母细胞发育潜能优于体外培养成熟的卵母细胞，同样，单次电激的卵母细胞优于多次电激的卵母细胞。因此科学家们采用的是在体内发育成熟的卵母细胞。

　　从胚胎中分离的纤维原细胞，在特别的细胞培养液中培养，（细胞培养液是经过抗胰蛋白酶消化的发育24天的胚胎），16天后，不再加入营养液，细胞将停留在G0期。

　　采用高压显微操纵技术，在含细胞松弛素B的NCSU2培养液中将去核的卵母细胞打散，除去周围附着的极体，并用显微注射技术将核导入卵细胞内。38.5℃培育3-4小时后，用电刺激并培养新合成的胚胎细胞。

　　体外培养长势良好的胚胎细胞必须顺利送入代理母亲体内着床，为了得到更好的结果，研究人员分别采用已受孕（体内环境帮助作用）和未受孕的代理母猪，结果已受孕的母猪产下自己怀孕的小猪，而人工放置的克隆胚胎遭到淘汰。只有在未受孕组别，注射了36个克隆胚胎的代理母亲顺利怀孕，于2000年7月2日产下Xena，出生体重为1.2Kg，胎盘重0.3Kg。胎盘在解剖学上显然是正常的，某些失败的克隆牛和克隆鼠，他们的胎盘都不正常。

　　研究者们分析克隆成功的原因认为，首先通过高压显微管进行的显微操作使得实验过程进行得较为快速是原因之一；另外，克隆的成功与否对供体细胞胞质污染较为敏感，比细胞融合技术要好的是，显微注射技术选择性地除去供体细胞的胞质，相对而言稀释了早期胚胎的胞质。

PPL公司克隆猪技术


--------------------------------------------------------------------------------

　　　PPL公司是一家专门从事核移植和转基因技术的公司，多利就是PPL公司赞助罗林斯实验室研究出来的。今年8月17日，PPL公司的研究人员在《自然》杂志上发表了一篇题为《用成年体细胞克隆猪》的论文，在论文中，研究者们详细地介绍了他们克隆的五只小猪的方法。与众不同的是，克隆这五只小猪的方法是“两步核转移法”。

　　目前，体细胞克隆的技术尚不稳定，成功率亦很低，约1-2%。有很多影响因素，包括不同实验室的差异，卵母细胞的来源和质量，胚胎的培养方法（有些品种，如牛的要求较高，而猪则相对较低），供者细胞类型，重组胚胎的体细胞核物质的丢失，卵母细胞不能顺利接受转移的核物质，以及最终不能顺利模仿受精过程中膜介导的复制过程。

　　猪的核移植其难度就在于难以得到发育得足够好的胚胎细胞。PPL公司的研究者们从以下四方面来解决他们的难题：卵细胞的激活，供体细胞的选择，胚胎的培养，以及受孕的诱导。

　　1、 卵细胞的激活：一般的物种，多采用MII期的卵母细胞作为受体，在此过程中，激活卵母细胞的方法是关键。PPL公司采用合体细胞作为胞质受体，可避开人工激活过程中的误差，而且成功可能性将更大。由于在移核过程中，受体细胞可能缺少某些必需物质，发育到后期的胚胎不易成熟。采用合子作为受体，其中含有原核所必须的营养物质，因而有可能更加成功。Kwon和Kono首先在小鼠体内完成此方法，将已接受核移植的卵母细胞在含细胞松弛素B的液体中激活，细胞松弛素防止极体的形成，同时卵母细胞将形成两个假原核。将假原核转入去核的在体内发育成熟的合子细胞中，然后置于代理母亲体内。

　　2、 细胞培养液的选择。由于不同的细胞系其培养要求差异较大，而核移植的细胞培养尚无公认配方。针对不同的细胞系其影响因素有如下几点：细胞代谢时的氧化损伤，基因组的不稳定及染色体病理。所有这些因素都受细胞分离和培养，及细胞的倍增系数的影响。PPL公司的研究者们经过比较后，采用粒层细胞作为供体细胞，粒层细胞在培养中所需的处理最少，使用的细胞未经冰冻处理。

　　3、 胚胎的形成。PPL公司的研究者采用以下方法（1）体内来源的原料，（2）尽量避免人工激活，（3）尽量缩短胚胎体外培养的过程，来使实验尽量成功。

　　如图所示，PPL公司的胚胎形成采用两步法（改良的Kwon 和Kono方法）。第一步，受体细胞与体外培养并去核的MII卵母细胞融合。当第一次移核的卵母细胞生成假原核后，将之再次转移到体内生成的去核合体细胞中，此为第二步移植。将第二步移植的胚胎转移入融合两小时内同步的代理母亲输卵管中，代理母亲用PMSG（pregnant mare serum gonadotropin）和hCG（human chorionic gonadotropin）处理，诱导并保持怀孕状态。

关于克隆的一些问答


--------------------------------------------------------------------------------

　　　1　什么是克隆？
　　克隆的定义是独立细胞繁殖系，指后代完全由一个细胞复制，具有完全相同的遗传物质。它是特制一种生物学操作。
　　2　单性繁殖就是克隆吗？
　　克隆是无性繁殖，但无性繁殖不一定就是克隆。且不说植物，就是许多低等动物，都可以在雌雄同体的情况下，进行孤雌生殖，由于有雌、雄配子的结合，染色体进行了交换，它的后代的遗传表现产生了变化。高等动物中，火鸡也可以自我孤雌生殖，且发生频率颇高。但那不是克隆。
　　3　无性繁殖是克隆么？
　　也不一定。即使是无性繁殖，也不能保证染色体不发生变化。
　　4　可以利用克隆技术来挽救濒危动物吗？
　　一般来说，不可以。挽救濒危动物需要提高他们的繁殖能力。而克隆做的是另外一件事情：得到遗传结构完全相同的后代；而且克隆技术无论如何都是一个降低繁殖能力的办法。但是，中国科学院的陈大元先生的想法有些道理。尽管可行性还不明朗。感兴趣可以看这里。
　　值得注意的是，我们应当尽快保存那些濒危动物尽量多个体的活细胞，也许技术的进步可使他们在以后得到挽救。
　　5　克隆是遗传学的重大突破吗？
　　克隆不是遗传学范畴的事情。他是一种繁殖技术。大家现在所说的克隆，实际是指核移植。就是将一个动物的细胞核，移植到卵细胞中，并发育生长。
　　6　什么是核移植？
　　就是将一个动物的细胞核，移植到卵细胞中，并发育生长。我国的农业科学院畜牧研究所早在90脑袋初就成功地进行了牛胚胎细胞核移植，小牛生长情况良好。
　　7　为什么说英国罗撕林研究所克隆的多利养是一个突破？
　　过去的看法认为，高等动物的成熟个体的细胞已经高度分化，已经不能够再象最开始的胚胎细胞那样，继续分化。但是多利羊的获得改变了这一看法。当然，他们采取了一定技术措施使分化后的提细胞核休眠。
　　8　对于哺乳动物，都有那些克隆的方法？
　　有一些克隆是天然的。比如同卵双胞胎，就是一个胚胎，由于某种原因裂为两个，他们各自形成一个个体。胚胎切割也是一种克隆的方法。将一个有几十个细胞的胚胎切成两份、四份甚至八份，每份都可以成长为一个个体，他们的遗传结构是完全相同的。这是一个比较古老的技术，7-80年代就很成熟了。有技术高超者，左手拿放大镜，右手拿刀片就可以完成这个工作。胚胎细胞的核移植是一种方法。成体细胞的核移植又是一种方法。
　　9　克隆有什么实际意义？
　　克隆出来的动物个体具有完全相同的遗传结构，他的意义在于：
　　A生物学和医药研究。
　　B获得更多的优秀动物个体用于生产。
　　C成体细胞核移植的意义在于，他可以复制生产高价药物的动物。这也是克隆技术发展的动力所在。
　　英国科学家找到了叫羊、牛、兔子等动物产的奶中含有非常值钱的药物的方法。但是他们的后代却不在有这样的能力，因为遗传物质发生了变化。现在看来，克隆-成体细胞的核移植是一个很好的解决问题的方法。
　　10　可以克隆人吗？
　　当然可以。即使是成体细胞核移植，在理论上也是可以的。技术上还没有看到什么不可逾越障碍。韩国的科学家已经做了先导实验，成功了，不过他们没有让这个“人”长大成人。但是，很多国家都禁止这种克隆人的产生。

目前的克隆技术也许不一定能克隆出健康的孩子，但至少提供了失败的经验。或许还可以有个乐观的想法：当他们失败的一塌糊涂的时候，会知道自己的想法是多么荒谬。它也许不可以告诉我们“这是可能的”，但至少可以告诉我们“这也是不可能的”，人类对自身的认识由此又可以前进一步，排除的谬误越多，是不是离真理又近了些呢？

http://www.bio-engine.com/plaza/wmagazine/magazine_detail.asp?id=938&a_index=25

有关克隆技术的站点：
·Genomics -- 由美国医药研究中心和国家生物科学研究所维护，收集了有关遗传和克隆研究的站点连接
·Cloning Bibliography --有关克隆技术的和生物伦理学的参考书目汇萃
·Yahoo 有关克隆的站点
·Christian Science Monitor杂志有关克隆的专题
·多莉的诞生地-----Roslin 研究所
·PPL公司主页
·NewScientist:CLONING SPECIAL REPORT
·Conceiving a CloneScientific American:A Clone in Sheep's Clothing
·克林顿总统关于人类克隆的声明
·提交给法国总统的关于克隆的备忘录




有关生物伦理学的站点：
·宾州大学生物伦理研究中心
·美国国家生物伦理学顾问委员会
·威斯康星医学院生物伦理学教育中心
·Human Cloning Foundation 一个支持人类克隆的站点
·HUMAN CLONING:Science, Ethics and Public Policy 旧金山大学主办
·Bioethics Resources on the Web (National Institutes of Health)
·Ethical, Legal and Social Implications Program (ELSI) of the National Human Genome Research Institute

1885年　August Weismann提出细胞遗传信息决定细胞功能的理论
　　1902年　Walter Sutton证明染色体携带遗传信息
　　同年，Hans Spemann 发现胚胎早期细胞保留了个体的所有信息
　　1928年　Hans Spemann 进行了首次核移植实验
　　1938年　Hans Spemann预言了克隆高级生物的可能性
　　1944年　Oswald Avery 发现遗传物质存在于细胞中的核酸中
　　1952年　Briggs 和 King克隆了蝌蚪
　　1953年　Watson and Crick发现DNA双螺旋结构
　　1958年　F.E. Steward利用完全分化的胡萝卜根细胞，培养出了胡萝卜植株
　　1962年　John Gurdon 声称通过成年蛙细胞成功克隆蛙
　　1963年　J.B.S. Haldane 创造“克隆”（clone）一词
　　1966年　基因编码规律被发现
　　1967年　DNA连接酶被分离
　　1969年　分离第一个基因
　　1970年　首次分离DNA限制性内切酶
　　1972年　第一个重组DNA分子产生
　　1978年　科幻作家David Rorvik发表其颇有争议的小说《In His Image: The Cloning of a Man》描述了一个富翁买通科学家“克隆”了他自己的过程，由此引起了关于克隆伦理的讨论
　　1979年　Karl Illmensee 宣布运用核移植法成功克隆了3只小鼠，但该结果没有得到科学界公认
　　1980年　美国联邦高等法院规定“人造生命享有专利”, 这一法案引起了一股建立生物技术公司的热潮，开创了生物技术的新时代
　　1983年　Kary B. Mullis发明PCR法
　　1984年　丹麦科学家Steen Willadsen成功利用胚胎细胞克隆出一头绵羊，这是首次证实的通过核移植技术克隆哺乳动物
　　1985年　Willadsen 加入了Grenada Genetics，参与了利用克隆技术培育奶牛的项目。和Grenada Genetics公司一样，许多生物技术公司也看到了克隆技术潜在的商业前景，纷纷加入，开辟了一个生物产业化的新时代
　　1986年　Steen Willadsen 在Grenada Genetics成功运用已生长一周的胚胎细胞克隆出一头母牛。这项工作证明细胞的遗传信息并未随细胞的分化而消失，分化细胞能够恢复其全能性。虽然这一成果未公开发表，但启发了“多莉之父”Ian Wilmut尝试用成年体细胞作为克隆供体细胞，从而在1996年成功培育出了多莉。
　　　　　　同年，威斯康星大学的Neal First, Randal Prather, 和Willard Eyestone几乎与Steen Willadsen 同时完成了早期胚胎细胞克隆母牛的实验。
　　1990年　人类基因组计划开始
　　1995年7月, 苏格兰Roslin研究所的Ian Wilmut 和Keith Campbell 运用早期分化的胚胎细胞克隆出了两头绵羊，命名为Megan 和Morag, 这被看作是多莉诞生的前奏
　　1996年7月5日　第一个用成年体细胞克隆产生的哺乳动物---------绵羊多莉（Dolly）诞生
　　1997年3月4日　鉴于多莉诞生引起的对人类克隆问题的争论，克林顿政府宣布美国联邦政府在5年内将不会投资与人类克隆相关的研究，同时要求国家生物伦理顾问委员会对相关的研究项目作出评估。
　　1997年12月5日　哈佛大学Richard Seed宣布他将在禁止克隆人类的联邦法律出台以前完成人类的克隆。此举对于已呈白热化的有关人类克隆和伦理的讨论无异火上浇油。
　　1998年7月　夏威夷大学Ryuzo Yanagimachi, Toni Perry, 和Teruhiko Wakayama 宣布自 1997年10以来他们已经成功运用成年体细胞克隆出了50只小鼠。他们运用的由Wakayama业余时间发明的Honolulu技术比用于克隆多莉的技术更加先进和有效。
　　1999年9月　美国A&M大学研究人员用来自一头21岁公牛的体细胞作为供体克隆出一头小牛
　　1999年　英国PPL公司获得批准在新西兰培育含有人类基因的克隆羊
　　2000年3月　PPL公司宣布成功培育５只克隆猪
　　2000年8月　英国政府允许克隆人类胚胎供医学研究之用
　　2000年8月　日本科学家宣布培育出克隆猪Xena

意大利一生殖学家声称世界首个克隆人即将诞生

发布时间:2002-10-21 08:10:27 来源:中国新闻网


　　中新网10月21日电 克隆人类的“先行者”、意大利生殖学家安蒂诺里说，他的第一个克隆人即将在一处“秘密的地方”诞生。

　　据香港文汇报引述英国媒体报道，去年春天，安蒂诺里说，他已从100名女性体内获取卵子，并进行“基因重编程序”，这实际上就是运用克隆技术，用一名男性配偶的细胞核取代卵子的细胞核。

　　今年四月，安蒂诺里又宣布已成功用克隆技术令三名妇女怀孕。据称，这三名妇女将生出世界首批克隆人。

　　英国胚胎学家相信，这位著名意大利医学专家可能已取得成功。

　　伦敦学院人类基因与胚胎学讲师哈佩尔指出，这种技术并不复杂，但由于不可避免会产生遗传缺陷，其他科学家都望之却步。每一只克隆生物都有某种缺陷。

　　据悉，该技术需要在克隆胚胎有八个细胞时除去一至二个细胞，然后分析它们存在何种缺陷。英国科学家爱德华相信安蒂诺里用猴子做过这类实验。

　　意大利禁止克隆生物，严格管制一切形式的人工受孕治疗。因此，安蒂诺里被迫到国外进行克隆人的工作。他1994年曾成功协助一名62岁的妇女生下婴儿，令全世界感到震惊。

美国学术界对禁止克隆人持不同见解
【2002-2-20 16:03:00】
_____________________________________________________________


【日经BP社报道】提供人工授精服务的美国Andrology研究所所长Michael Zavos表示，如果美国政府禁止进行人类克隆的话，“我的研究组织将转移到可以合法进行人类克隆的国家，我们愿为苦于不育的夫妇克隆婴儿”。目前Zavos的研究所已经接到了3000多对没有孩子的夫妇的咨询。

　　Zavos说：“每个人都希望拥有与自己有血源关系的孩子”，并且，“目前全面禁止克
隆人的美国联邦政府法律已成为这一研究领域的重大障碍，并造成了研究人员的外流”。他还表示，“我们并非只能在美国进行人类克隆，世界上还有170多个国家允许克隆人，在那些国家也可以进行研究。”

　　而另一方面，反对进行人类克隆的加利福尼亚大学教授Paul R. Billings则主张：“无论谁进行人类克隆，都应该以犯罪论处”。他的理由不是出于政治或伦理上的原因，而是因为还没有在科学上证实克隆人的安全性。

　　而Zavos则表示：“在动物克隆中成功率已达30%以上，我们希望今后的研究成果会对不育夫妇有所帮助。”

摘自《新华社》